Segni del microbioma intestinale dell’adattamento all’ambiente estremo nel maiale tibetano

npj Biofilm e microbiomi volume 9, numero articolo: 27 (2023) Citare questo articolo

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I maiali tibetani (TP) possono adattarsi agli ambienti estremi dell’altopiano tibetano implicati dai segnali del loro autogenoma, ma si sa poco sui ruoli del microbiota intestinale nell’adattamento dell’ospite. Qui, abbiamo ricostruito 8210 genomi assemblati con metagenoma da TP (n = 65) che vivono in suini in cattività ad alta e bassa quota (87 dalla Cina - CP e 200 dall'Europa - EP) che sono stati raggruppati in 1050 contenitori genomici a livello di specie (SGB) alla soglia dell'identità nucleotidica media del 95%. Il 73,47% degli SGB rappresentavano nuove specie. L'analisi della struttura della comunità microbica intestinale basata su 1.048 SGB ha mostrato che i TP erano significativamente diversi dai suini in cattività a bassa quota. Gli SGB associati a TP hanno permesso di digerire più polisaccaridi complessi, tra cui cellulosa, emicellulosa, chitina e pectina. In particolare, abbiamo scoperto che i TP mostravano l'arricchimento più comune dei phyla Fibrobacterota ed Elusimicrobia, che erano coinvolti nella produzione di acidi grassi a catena corta e media (acido acetico, butanoato e propanoato; acidi ottanomico, decanoico e dodecanoico), nonché di nella biosintesi del lattato, 20 aminoacidi essenziali, molteplici vitamine del gruppo B (B1, B2, B3, B5, B7 e B9) e cofattori. Inaspettatamente, i Fibrobacterota hanno mostrato esclusivamente una potente capacità metabolica, inclusa la sintesi di acido acetico, alanina, istidina, arginina, triptofano, serina, treonina, valina, B2, B5, B9, eme e tetraidrofolato. Questi metaboliti potrebbero contribuire all’adattamento dell’ospite all’alta quota, come la raccolta di energia e la resistenza all’ipossia e alle radiazioni ultraviolette. Questo studio fornisce approfondimenti sulla comprensione del ruolo svolto dal microbioma intestinale nell’adattamento dei mammiferi all’alta quota e scopre alcuni potenziali microbi come probiotici per migliorare la salute degli animali.

Il maiale tibetano (Sus scrofa domesticus) è una razza indigena originaria dell'altopiano del Qinghai-Tibet che può sopravvivere a lungo termine in ambienti difficili ad alta quota, come ipossia, freddo intenso, intensa radiazione ultravioletta (UVR) e scarsità di cibo1, 2,3. Pertanto, comprendere il meccanismo di adattamento del maiale tibetano all’alta quota è molto importante per la scoperta di nuovi componenti genetici coinvolti nella resistenza allo stress. L'analisi genomica ha scoperto 268 geni sottoposti a selezione positiva nei cinghiali tibetani che sono correlati agli adattamenti all'alta quota, come il mantenimento della stabilità genomica contro i raggi UV e l'adattamento molecolare in condizioni di ipossia4. Più specificamente, questo studio ha identificato tre geni leganti la vitamina B6 (ALB, SPTLC2 e GLDC) che aiutano nella sintesi dell'emoglobina e migliorano il legame dell'ossigeno e quattro geni correlati all'ipossia (ALB, ECE1, GNG2 e PIK3C2G). Ulteriori studi hanno rilevato mutazioni genetiche nei geni PLA2G12A ed EPAS1 correlate alla variazione fenotipica del tono vascolare polmonare e della concentrazione di emoglobina5. Recentemente, ulteriori studi hanno prestato attenzione anche alle tracce del microbioma intestinale legate all’adattamento all’alta quota nel maiale tibetano, a causa del ruolo essenziale che il microbiota intestinale ha svolto nel metabolismo nutrizionale6,7, nella regolazione energetica8,9 e nello sviluppo del sistema immunitario per il mantenimento della salute dell’ospite10,11. Ad esempio, una meta-analisi ribosomiale 16 S ha rivelato i tre batteri intestinali più abbondanti Acinetobacter, Pseudomonas e Sphingobacterium nei suini tibetani rispetto ai suini a bassa quota12. L'analisi metabolomica di 12 campioni fecali di suini tibetani d'alta quota ha dimostrato che le produzioni di acido propanoico e acido ottadecanoico erano significativamente migliorate e anche i geni correlati a questi due metaboliti erano sovraregolati12. In breve, questi risultati indicano che gli ambienti ad alta quota hanno modellato il microbioma intestinale unico e la diversità funzionale del maiale tibetano. Tuttavia, non è chiaro circa la diversità e il panorama funzionale del microbiota intestinale nel maiale tibetano e la sua firma per l’adattamento dell’ospite ad alta quota, a causa delle limitazioni della piccola dimensione del campione e della bassa profondità di sequenziamento metagenomico negli studi precedenti.

75% and contamination <10%22,23 (see "Methods"; Fig. 1A). In total, 3807 of these MAGs were high-quality genomes with >90% completeness with <5% contamination (Fig. 1B). After de-replication at an average nucleotide identity (ANI) threshold of 95%24, 1050 SGBs were identified for further analysis (see "Methods"). We used at least 40% genome coverage to determine the presence of SGBs in each sample, and 1048 representative SGBs were finally obtained, of which 623 SGBs (59.45%) were high-quality genomes (>90% completeness and <5% contamination) (Supplementary Table 2). Each SGB was supported by an average of 7.8 MAGs and 57.25% of SGBs contained at least two MAGs (Supplementary Table 2). We used the genome taxonomy database toolkit (GTDB-Tk)25 to perform taxonomic assignment of the SGBs (see "Methods)". The results showed they were classified into 20 bacterial phyla and one archaea phylum, 90.74% of SGBs were assigned to known genera, and 73.47% of SGBs were unclassified species (named uSGBs) (Fig. 1C). Besides, 45.04% of 1048 SGBs were assigned into Firmicutes A, 25.86% to Bacteroidetes, 6.97% to Firmicutes, and 5.63% to Proteobacteria (Supplementary Table 3). The prevalence and classification of SGBs in TPs, EPs and CPs were shown in Fig. 1D, indicating the differences of microbial community at phylum-level between three groups. Additionally, functional gene profiles of 1048 SGBs were predicted using MetaGeneMark (v.3.38)26 (see "Methods"). All gene annotations were performed by using the Carbohydrate-active enzymes (CAZymes)27 and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Orthology (KO)28 databases (see "Methods")./p>50% completeness and <5% contamination) and 2673 SGBs (ANI ≥ 95%) from gut microbiome dataset from 500 Chinese pigs. To explore the uniqueness of our identified SGBs, we integrated our 8210 MAGs with Chen's dataset and kept the MAGs with >75% completeness and <5% contamination for the identification of SGBs at the threshold of ANI ≥ 95%. A total of 2266 SGBs were finally obtained. 1248 (55.08%) of them were unique to Chen's study, 519 (22.90%) to this study and 499 (22.02%) were overlapped (Supplementary Fig. 1). This finding indicates that ongoing efforts are needed for understanding the pig gut microbial diversity./p> 0.05), and the colors indicate enriched groups./p> 90% completeness and < 5% contamination (Supplementary Table 2). Hence, we performed KO annotation and enrichment analysis of KEGG pathways to decipher their functional potential. The results showed that there were 38 KEGG pathways significantly enriched in the SGBs of Fibrobacterota and 39 pathways in the SGBs of Elusimicrobia, respectively (Supplementary Table 6, Fisher's test, p < 0.05, FDR corrected). Overall, the two phyla bacteria exhibited different metabolic characteristics, even though the most enriched ten pathways in them both included translation, replication and repair, signal transduction and energy metabolism (Fig. 4, Fisher's test, p < 0.001). Fibrobacterota was particularly involved in the metabolism of cofactors and vitamins, as well as amino acid metabolism, and Elusimicrobia mostly participated in glycan biosynthesis and metabolism, as well as carbohydrate metabolism. Additionally, enriched pathways involved in amino acid metabolism were distinct between Fibrobacterota and Elusimicrobia (Fig. 4 and Supplementary Table 6, Fisher's test, p < 0.05, FDR corrected). For example, Fibrobacterota was significantly enriched in the pathways of valine, leucine and isoleucine biosynthesis (Fisher's test, p = 0.002), alanine, aspartate and glutamate metabolism (Fisher's test, p = 0.010), arginine biosynthesis (Fisher's test, p = 0.014), phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis (Fisher's test, p = 0.023), lysine biosynthesis (Fisher's test, p = 0.025), histidine metabolism (Fisher's test, p = 0.025), cysteine and methionine metabolism (Fisher's test, p = 0.032). Elusimicrobia preferred to lysine biosynthesis (Fisher's test, p = 0.0174), and glycine, serine and threonine metabolism (Fisher's test, p = 0.0277)./p>

500 bp were aligned to reads using BWA(v.0.7.12)57. The coverage and depth of contigs were then computed by using Samtools (v.1.9)58 and Bedtools (v.2.27.1)59. We performed MetaBAT260 to bin the assembled contigs into putative genomes (MAGs) within each sample based on tetranucleotide frequency and abundance(or average depth) of contigs. Subsequently, CheckM (v.1.0.7)61 was used to estimate the completeness and contamination of MAGs by lineage-specific markers genes and default parameters. Generally, recovered MAGs with completeness >50% and contamination < 10% were considered medium or high-quality62,63,64, but we set up a more strict threshold for medium quality as completeness > 75% and contamination < 10%22,23. The MAGs with completeness > 75% and contamination < 10% were retained for further refinement and validation. We used RefineM (v.0.0.14)22 to filter the bins with divergent genomic properties, with incongruent taxonomic classification and with incongruent 16 S rRNA genes using default parameters. CheckM (v.1.0.7) was re-run to assess the genome quality of the retained MAGs. 8210 high-medium quality MAGs (completeness 75% and contamination 10%) were obtained. Then, those MAGs were clustered into species-level genomes using dRep (v.2.6.2)65 with default parameters of Mash66 and ANIs67 (at the threshold of 95%). The genomes with maximum genome quality score (completeness-5X contamination + 0.5logN50) in each cluster were selected as representative SGBs. SGBs with coverage greater than 40% in a sample were determined to be present in this sample. So a total of 1048 representative SGBs in pig gut were finally reconstructed in this study (Supplementary Table 2)./p>