Le microglia umane mostrano cambiamenti trascrizionali unici nella malattia di Alzheimer

Nature Aging (2023) Citare questo articolo

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Le microglia, le cellule immunitarie innate del cervello, influenzano la progressione della malattia di Alzheimer (AD) e sono potenziali bersagli terapeutici. Tuttavia, le microglia esibiscono diverse funzioni, la cui regolazione non è completamente compresa, complicando lo sviluppo di terapie. Per definire meglio i fenotipi trascrittomici e le reti di regolazione genetica associate all'AD, abbiamo arricchito i nuclei della microglia di 12 AD e 10 cortecce prefrontali dorsolaterali umane di controllo (7 maschi e 15 femmine, tutti di età superiore a 60 anni) prima del sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo. Qui descriviamo i fenotipi molecolari microgliali sia consolidati che precedentemente non riconosciuti, le reti genetiche dedotte che guidano il cambiamento trascrittomico osservato e applichiamo l'analisi della traiettoria per rivelare le presunte relazioni tra i fenotipi microgliali. Identifichiamo i fenotipi microgliali più prevalenti nei casi di AD rispetto ai controlli. Inoltre, descriviamo l'eterogeneità nei sottocluster di microglia che esprimono marcatori omeostatici. Il nostro studio dimostra che la profilazione profonda della microglia nel cervello umano con AD può fornire informazioni sui cambiamenti trascrizionali microgliali associati all'AD.

La malattia di Alzheimer (AD) è patologicamente caratterizzata da placche extracellulari di beta-amiloide (Aβ), grovigli neurofibrillari intracellulari neuronali e neuroinfiammazione. L'interesse per la neuroinfiammazione come caratteristica modificabile della patologia di AD è cresciuto in concomitanza con gli studi genetici che identificano varianti di rischio di AD localizzate in regioni codificanti e non codificanti di geni espressi unicamente dalle cellule mieloidi cerebrali1. Le microglia sono cellule mieloidi immunitarie innate residenti nel cervello e contribuiscono ai processi neuroinfiammatori ipotizzati per promuovere la fisiopatologia dell'AD2,3,4,5,6,7,8,9,10. Studi precedenti hanno suggerito che, nell'AD, la microglia rilascia mediatori infiammatori che influenzano il comportamento e la funzione dei neuroni circostanti, mentre la glia perde le funzioni neuroprotettive e avvia la fagocitosi aberrante delle sinapsi e dei neuroni3,7,11,12. Le microglia sembrano contribuire alla diffusione di tau nei sistemi modello13,14 e sono probabilmente il tipo di cellula primaria coinvolta nella rimozione di Aβ, inclusa la riduzione di Aβ osservata in risposta ad approcci immunoterapeutici basati su anticorpi15. Pertanto, i comportamenti infiammatori delle microglia sono rilevanti per la progettazione del bersaglio terapeutico. Tuttavia, permangono ampie lacune nella nostra comprensione delle risposte della microglia nel cervello di AD.

I fenotipi della microglia si differenziano per morfologia, fisiologia e modelli di espressione genica o proteica. Gli esperimenti condotti su sistemi modello suggeriscono che è probabile che queste caratteristiche eterogenee siano associate a specifici fenotipi funzionali della microglia10,16,17,18,19,20,21. Meno si sa circa l’eterogeneità dei fenotipi della microglia nel cervello umano adulto, soprattutto nel contesto di stati patologici specifici, come l’AD. Studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula e a singolo nucleo (snRNA-seq) su tessuto corticale umano fresco e congelato hanno rivelato molteplici fenotipi trascrizionali della microglia nel contesto dell'AD e di altre patologie cerebrali22,23,24,25,26,27,28, 29. Distinguere cluster trascrittomicamente distinti consente l’identificazione di fattori genetici ed epigenetici candidati che regolano comportamenti cellulari specifici, che potrebbero essere sfruttati negli approcci terapeutici di precisione. Tuttavia, i metodi standard snRNA-seq spesso includono un piccolo numero di microglia per individuo. Un basso numero di cellule può diminuire la capacità di mappare l'intera gamma di fenotipi trascrizionali microgliali e limitare la capacità di identificare il cambiamento dell'espressione genica associato alla malattia all'interno di un cluster o sottocluster. Abbiamo ipotizzato che ulteriori processi cellulari e fattori regolatori dei fenotipi trascrizionali delle microglia sarebbero stati scoperti utilizzando set di dati che contengono un numero molto maggiore di microglia per singolo campione.

1.25. Cluster 1 was annotated as inactivated, often referred to as ‘homeostatic’ in single-nucleus studies of microglia. Differential gene expression analysis was repeated as above comparing each other cluster to cluster 1. GSEA was performed in ClusterProfiler69 modified to use a set seed for reproducibility, using the GO, KEGG and Reactome pathway sets, version 7.2. Enriched pathways had an FDR-adjusted P < 0.05. We considered pathways to be representative if significant results included similar genes and biological functions in at least two of the three major databases (GO, KEGG and Reactome)./p>60 years. Because the samples were obtained from humans, and the study was designed to detect differences between AD cases and healthy aged brains, the samples were not randomized between conditions. We counterbalanced sequencing batches by sex and disease status such that all conditions were present in each sequencing batch. Statistical analysis for pseudobulk RNA-seq data and snRNA-seq data used DESeq2 and MAST, respectively. DESeq2 is designed to model the RNA-seq count data by a negative binomial distribution, and MAST is designed to model the zero inflation observed in snRNA-seq data. For statistical analysis of cluster proportion, counts data were used, which does not rely on a normal distribution. When the dataset was downsampled for trajectory analysis and regulon detection, the nuclei were randomly downsampled to generate multiple iterations of the dataset that evenly represented the clusters and kept the samples in their original proportions. For trajectory analysis, three downsampled permutations at three downsample resolutions (1,000, 2,000 or 3,000 nuclei per cluster) were analyzed for a total of nine iterations, resulting in similar findings as those displayed in Fig. 4. For pySCENIC regulon detection, the dataset was downsampled with five permutations at 1,000 nuclei per cluster and three permutations at 2,000 and 3,000 nuclei per cluster. Each of these permutations was run through the pySCENIC pipeline multiple times, resulting in 27 instances of regulon detection. These 27 instances were compiled into the consistency scores displayed in Fig. 3 and Extended Data Fig. 6. Experiments involving immunohistochemistry of human tissue were replicated on, at minimum, samples from five humans, and images displayed are representative of staining observed in multiple fields of at least three human samples./p>